INTRODUCCIÓN:
Los espermatozoides y óvulos son las células esenciales para la reproducción en mamíferos. En la actualidad existe de un 13% a 18% de casos de infertilidad originados por producción deficiente de espermatozoides que afecta a parejas en edad reproductiva. Otras causas de infertilidad incluyen: bajo número de espermatozoides, edad avanzada de las parejas que desean un embarazo por primera vez, la incidencia creciente del síndrome poliquístico de ovario y las enfermedades transmitidas sexualmente.
El objetivo que se plantea entonces, es el de obtener gametas de individuos estériles para poder utilizarlas en fertilización in vitro y de esta forma, no solo solucionar problemas de infertilidad, sino también abrir ventanas a homosexuales que deseen tener hijos biológicos. Adicionalmente el estudio proveerá de gran cantidad de información respecto a la gametogénesis, meiosis y reprogramación nuclear.
En los últimos años se ha estudiando en profundidad la espermatogénesis a partir de células somáticas, que como ya se ha dicho, plantea el mayor problema de esterilidad en la actualidad. Este procedimiento es complejo ya que conlleva varias etapas.
En un primer lugar estas células somáticas deben desdiferenciarse a stem cells embrionarias, que son células totipotenciales capaces de generar un organismo. El paso siguiente es obtener células primordiales germinales que son las células pluripotentes que desarrolla el embrión para producir gametas luego del nacimiento. Por último, se debe estimular la gametogénesis a partir de las células primordiales germinales obtenidas en el paso anterior.
OBTENCIÓN DE STEM CELLS EMBRIONARIAS (ESCs).
Se han planteado dos importantes estrategias para obtener ESCs a partir de células somáticas. La inducción directa por un cóctel de factores de transcripción y, la más utilizada para esta investigación, la clonación por transferencia nuclear.
CLONACIÓN
La generación de ESCs a partir de transferencia nuclear genera una célula genéticamente idéntica al individuo dador del núcleo somático.
Los factores citoplasmáticos presentes en ovocitos maduros, arrestados en metafase II, tienen la capacidad de reprogramar el núcleo del espermatozoide asegurando el correcto desarrollo embrionario. Esta actividad de reprogramación intrínseca del ovulo es utilizada para reprogramar un núcleo somático, de “resetearlo” al estado embrionario inyectándolo en ovocitos y obtener así embriones por transferencia nuclear (embriones SCNT). Estas ESCs son células totipotenciales capaces de generar cualquier célula del individuo, es decir, mediante estas células es posible obtener la estirpe germinal.
Sin embargo, esta técnica no tiene una eficiencia muy alta. En primer lugar, se debe extraer previamente el núcleo del óvulo, para evitar la poliploidía que se genera con la inyección del núcleo somático. Por otro lado, suma complejidad el hecho de que extraer el núcleo del ovocito puede producir un cambio en los factores citoplasmáticos maternos que reducen su capacidad para la reprogramación. Superando los inconvenientes se ha logrado obtener ESCs con este método.
En comparación con la reprogramación clásica por fecundación, la reprogramación de núcleos somáticos no es tan eficiente como la reprogramación de la cromatina del espermatozoide.
En la espermatogénesis la cromatina es empaquetada de una forma distinta a una célula somática. En vez de envolver la cromatina mediante histonas, los espermatozoides empaquetan estrechamente el DNA con la adición de proteínas denominadas protaminas. La ventaja del empaquetamiento por protaminas es facilitar el control epigenético en la reprogramación ya que, una vez fecundado el óvulo, las nucleoplasminas (proteínas maternas) remueven las protaminas y seguidamente se adicionan al DNA paterno histonas maternas. De esta forma la reprogramación se vuelve más eficaz.
Se ha comprobado además, que existen zonas del DNA, del espermatozoide maduro, que conservan histonas y poseen un patrón de acetilación. Las zonas que conservan histonas corresponden a los promotores de los genes más importantes para el desarrollo. Dato que puede ser muy importante teniendo en cuenta que en individuos infértiles se observan perfiles anormales respecto a la retención de histonas, lo cual puede explicar la ineficiencia en el desarrollo embrionario luego de la fecundación.
En los espermatozoides obtenidos por transferencia nuclear se observan anormalidades epigenéticas similares ya que probablemente la ausencia del proceso de empaquetamiento por protaminas conlleva a la conservación de modificaciones epigenéticas de la célula somática que aportó el núcleo. Esta característica puede ser causa de la baja eficiencia de la clonación en comparación con la eficiencia en el desarrollo del embrión obtenido por fertilización clásica.
La solución planteada es entonces estimular el proceso de adición de protaminas al DNA somático, cuidando la presencia de histonas en los promotores de genes mas importantes como también los patrones de acetilación. Sin embargo, representa un gran desafío ya que el proceso involucra múltiples etapas altamente reguladas que no aseguran eficiencia en el desarrollo.
Brevemente, en la espermatogénesis, las histonas son reemplazadas por variantes histónicas que dan lugar a la hiperacetilación. Luego se realiza un reemplazo de las variantes por proteínas de transición que finalmente son sustituidas por protaminas.
Es posible que haya más impedimentos además de la compactación y acetilación del DNA, como por ejemplo RNAs encontrados en espermatozoides cuya función aun no se conoce pero podría tener un papel importante en la reprogramación nuclear.
Dejando de lado los impedimentos, se han logrado obtener gametas con epigenética normal, aunque en muy baja proporción.
OBTENCIÓN DE CELULAS GERMINALES PRIMORDIALES (PGCs)
Se ha demostrado en ratones la capacidad de las ESCs, tanto masculinas como femeninas, de diferenciarse en precursores germinales (PGCs) que pueden realizar meiosis y así formar estructuras similares a gametas. Para aislar estas células es fundamental conocer su migración y destino en el embrión.
En un comienzo, luego de la formación de la blástula, las ESCs se diferencian en las tres capas germinales: ectodermo, mesodermo y endodermo y en PGCs. En humanos la generación de PGCs se realiza a partir de la tercera semana del desarrollo. Durante la cuarta semana comienzan su migración hacia la zona gonadal y se establecen allí en la sexta semana. La migración está acompañada de extensa proliferación y alta actividad transcripcional. Los genes relacionados con la pluripotencialidad Oct4, Sox2 y Nanog cobran alta importancia en este proceso.
Tras entrar en la gónada, las PGCs comienzan a expresar genes (Dazl, Vasa, Gcna26) e interaccionar con el ambiente generado por las células somáticas gonadales. Este ambiente es el que va a determinar su compromiso con el destino específico del sexo. En hembras, las PGCs se diferencian en oogonias y posteriormente se arrestan en la profase I de la meiosis. El ácido retinoico, factor de crecimiento, estimula el inicio de la meiosis regulando el gen Stra827. En cambio, el acido retinoico en machos es degradado para detenerse en la fase G0/G1 del ciclo celular.
Dado el impedimento moral generado para trabajar con embriones humanos, la investigación se ha centrado en ratones. En la Argentina, luego de la reforma del código civil del 2015 se ha flexibilizado la normativa en cuanto al uso de embriones humanos en investigación. Sin embargo el tema está en vías de desarrollo y conserva aun obstáculos morales.
Se ha demostrado ampliamente que la gametogénesis es específica de cada especie y aunque el proceso de desarrollo embrionario en general se conserva entre mamíferos, hay diferencias que dificultan la traducción directa de los conocimientos adquiridos en ratón a humano.
En el ratón macho las células primordiales germinales migran hacia la zona gonadal dentro del día 10 al 12. Cuando llegan al mesenterio dorsal estas células son recubiertas por células de Sertoli y se desarrollan en gonocitos. Estos gonocitos proliferan por unos días y se mantienen arrestados en G0/G1 hasta el nacimiento. Unos días luego del nacimiento ocurre la espermatogénesis con la consecuente producción de gametas.
Se ha realizado el cultivo in vitro de PGCs sostenidas por un complejo cóctel de factores de crecimiento solubles, principalmente el ácido retinoico que es el factor de crecimiento más importante producido normalmente en el testículo. El acido retinoico simula el ambiente natural y promueve el desarrollo de las PGCs y posterior meiosis. Se ha logrado así obtener espermatozoides in vitro.
Luego de fertilización por inyección intracitoplasmatica de los espermatozoides artificiales en ovocitos normales de rata han nacido ratones vivos. Es de resaltar que 6 de los 7 llegaron a la edad adulta. Se afirma entonces, que se ha logrado obtener espermatozoides artificiales funcionales.
Sin embargo se observa alto porcentaje de disfuncionalidades que se atribuye a anormalidades epigenéticas del DNA, principalmente anormalidades en la metilación que influyen en la regulación de la expresión génica y que seguramente es el motivo por el cual gran cantidad de embriones en este experimento no lograron el correcto desarrollo.
Pocos estudios se han realizado respecto a la generación de óvulos artificiales dado que existen mayores dificultades para su obtención debido a la complejidad del óvulo como célula.
Finalmente, la obtención de óvulos y espermatozoides del sexo opuesto es el objetivo más desafiante de la investigación. Poco se ha logrado en este sentido, sin embargo fue posible avanzar en la obtención de espermatozoides a partir de células femeninas, aunque este esperma no resultó ser completamente funcional, detectándose anormalidades epigenéticas.
CONCLUSIÓN
Los avances en el conocimiento de la gametogénesis y desdiferenciación de células somáticas a ESCs en los últimos años han superado expectativas. Es claro que el próximo objetivo es lograr normalizar la epigenética de las gametas artificiales, que no es una tarea sencilla. Por otro lado se deberá investigar en mayor profundidad la generación de óvulos y la gametogénesis del sexo opuesto.
Para traducir experimentos de ratones a humanos va a ser necesario romper barreras morales que permitan experimentar con menor dificultad en células y embriones humanos, sin embargo observando la alta tasa de muerte embrionaria involucrada hasta el momento es posible entender el conflicto moral que se pone en juego en esta investigación.
Los científicos creen que dentro de pocos años va a ser posible superar las problemáticas actuales y obtener gametas funcionales que podrán resolver casos de infertilidad y dar la posibilidad a homosexuales de concebir hijos biológicos.
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